UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA

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UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA FACULTAD DE CIENCIAS AISLAMIENTO Y EVALUACIÓN DE MICROORGANISMOS NATIVOS COMO BIORREMEDIADORES DE SUELOS CONTAMINADOS CON CHLORPYRIFOS EN LA UNIVERSIDAD NACIONAL
UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA FACULTAD DE CIENCIAS AISLAMIENTO Y EVALUACIÓN DE MICROORGANISMOS NATIVOS COMO BIORREMEDIADORES DE SUELOS CONTAMINADOS CON CHLORPYRIFOS EN LA UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA Presentada por: María Pía Cedrón Tello María Luisa Lecaros García Trabajo Académico para Optar el Título Profesional de: BIÓLOGO Lima Perú 2018 UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA FACULTAD DE CIENCIAS AISLAMIENTO Y EVALUACIÓN DE MICROORGANISMOS NATIVOS COMO BIORREMEDIADORES DE SUELOS CONTAMINADOS CON CHLORPYRIFOS EN LA UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA Presentada por: María Pía Cedrón Tello María Luisa Lecaros García Trabajo Académico para Optar el Título Profesional de: BIÓLOGO Sustentada y aprobada por el siguiente jurado: Mg. Sc. Víctor Miyashiro Kiyan PRESIDENTE Ph.D. Lisveth Flores del Pino MIEMBRO Biol. Roberto Ramos Chaupin MIEMBRO Biol. Juan Juscamaita Morales ASESOR AGRADECIMIENTOS En primer lugar, queremos agradecer a nuestros padres, familiares y amigos más cercanos por su constante apoyo durante el desarrollo de este trabajo y a lo largo de nuestra formación profesional; ellos son parte importante del logro de nuestros objetivos académicos. En segundo lugar, estamos muy agradecidas con el permanente soporte de nuestro profesor y asesor Juan Juscamaita Morales, quien nos ayudó a plasmar mejor nuestros objetivos y nos encaminó durante el proceso de investigación. En tercer lugar, consideramos muy importante mencionar el gran apoyo del señor Eberth Adelmo Vicente Armas, responsable del laboratorio B2 de la universidad, en donde desarrollamos todos los estudios y quién estuvo a nuestra disposición con toda la logística que necesitamos para el presente trabajo. Y finalmente, también queremos reconocer la colaboración de los alumnos del curso de biología experimental: Franz Deyvis Tucta Huillca, Evelyn Michelle Quispe Rivera, Christian Rodrigo Eguizabal Marticorena y Grecia Torres Ccasani, quienes nos ayudaron mucho con algunos procedimientos, así como con la supervisión del estudio. ÍNDICE GENERAL I. INTRODUCCIÓN... 1 II. REVISIÓN DE LITERATURA Plaguicidas Definición Clasificación Efectos del uso intensivo de los plaguicidas Dinámica de los plaguicidas Características del plaguicida evaluado Biorremediación Definición y características Tipos de biorremediación Bioquímica de la biorremediación Beneficios e importancia de la biorremediación Criterios a tener en cuenta para la aplicación de la biorremediación Respiración y crecimiento microbiano como medida de la degradación de clorpirifos III. MATERIALES Y MÉTODOS Muestreo del suelo para su caracterización fisicoquímica y microbiológica Aplicación de clorpirifos en el suelo y obtención de la muestra a trabajar Aislamiento de microorganismos con potencial de degradación de clorpirifos Pruebas de biodegradación de clorpirifos IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Características físicoquímicas del suelo estudiado Caracterización microbiológica del suelo estudiado Aislamiento y selección de microorganismos tolerantes a clorpirifos Evaluación de la degradación de clorpirifos... 49 4.4.1 Por crecimiento microbiano Por respiración microbiana V. CONCLUSIONES VI. RECOMENDACIONES VII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS VIII. ANEXOS... 77 INDÍCE DE TABLAS Tabla 1: Clasificación de la solubilidad de los plaguicidas en agua Tabla 2: Criterios de adsorción de los pesticidas de acuerdo a FAO...13 Tabla 3: Clasificación de la movilidad en suelo basada en valores Koc..14 Tabla 4: Criterios de valoración, umbrales y categorías usadas para evaluar el potencial de bioacumulación en químicos Tabla 5: Clasificación de los plaguicidas de acuerdo a su peligrosidad..20 Tabla 6: Clasificación de los plaguicidas de acuerdo a su persistencia...22 Tabla 7: Resumen de los valores que indican el potencial contaminante de clorpirifos así como su potencial toxicológico Tabla 8: Cantidad de repeticiones (frascos) para cada tipo de muestra y ensayo...39 Tabla 9: Caracterización del suelo del campo de experimentación CIRGEBB...40 Tabla 10: Análisis microbiológico del suelo del campo de experimentación CIRGEBB...42 Tabla 11: Morfotipos bacterianos aislados del suelo del campo de experimentación CIRGEBB...43 Tabla 12: Hongos aislados del suelo del campo de experimentación CIRGEBB 46 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1: Destino de un plaguicida aplicado por avión. 8 Figura 2: Estructura química de clorpirifos Figura 3: Resumen de la significancia de la constante de Henry.16 Figura 4: Clasificación de las técnicas de remediación biológica 30 Figura 5: Curvas del comportamiento del conteo en cámara Neubauer de los tratamientos correspondientes al consorcio bacteriano 48 Figura 6: Evolución del crecimiento en placa de muestras bacterianas...50 Figura 7: Curva del comportamiento del conteo en cámara Neubauer de los tratamientos correspondientes al consorcio fúngico...53 Figura 8: Evolución del crecimiento de muestras fúngicas en placas Petri. 54 Figura 9: Curva de cuantificación de mg de C-CO2 producido durante la respiración bacteriana mediante el método de titulación. 56 Figura 10: Curva de cuantificación de mg de C-CO2 producido durante la respiración fúngica mediante el método de titulación..58 Figura 11: Curva de cuantificación de O 2 /CO 2 producido durante la respiración bacteriana medida con el analizador de gases Oxybaby Figura 12: Curva de cuantificación de O2/CO2 producido durante la respiración fúngica medida con el analizador de gases Oxybaby ÍNDICE DE ANEXOS Anexo 1: Medios de cultivo.77 Anexo 2: Hoja de Seguridad de Materiales de Lorsban 4E.79 Anexo 3: Análisis de suelo caracterización..98 Anexo 4: Análisis microbiológico del suelo 99 Anexo 5: Identificación de hongos Anexo 6: Registro fotográfico 101 RESUMEN Con el objetivo de evaluar si los microorganismos presentes en los suelos del campus de la Universidad Nacional Agraria La Molina son capaces de utilizar clorpirifos como fuente de carbono, energía u otros nutrientes, se aislaron colonias bacterianas y fúngicas con potencial capacidad biodegradadora del ingrediente activo en estudio a concentraciones baja, media y alta. Un total de doce bacterias y tres hongos aislados fueron incubados durante 14 días en medio mínimo de sales minerales con clorpirifos como única fuente de carbono, periodo en el cual se evaluó su respiración a través de la medición de CO2 desprendido como producto de la mineralización de carbono, de acuerdo al método de titulación descrito por Anderson (1982) para determinar la actividad microbiana. Para la medición de la respiración microbiana también se utilizó el analizador de O2/CO2 Oxybaby 6.0 y se compararon ambos resultados. Paralelamente, durante el mismo periodo de incubación, se analizó el crecimiento de los microorganismos aislados mediante recuento en cámara Neubauer y cultivo en placa con agar nutritivo y en agar Sabouraud, para bacterias y hongos respectivamente, como medida indirecta de la degradación de clorpirifos como única fuente de carbono. Es así que a través de la respiración microbiana y del crecimiento microbiano se evaluó la potencial capacidad biorremediadora de los microorganismos aislados sobre clorpirifos, la cual constituye una alternativa viable para la recuperación de suelos agrícolas contaminados con este pesticida organofosforado. Palabras claves: clorpirifos, degradación, respiración microbiana, suelo, biorremediación. ABSTRACT In order to evaluate if the microorganisms present on the campus of the Universidad Nacional Agraria La Molina are able to use chlorpyrifos as a source of carbon, energy or other nutrients, bacterial and fungal colonies with potential biodegradation capacity of the active ingredient under study were isolated at low, medium and high concentrations. A total of twelve bacteria and three fungal isolates were incubated on mineral salt medium spiked with chlorpyrifos as the sole carbon source during fourteen days, period in which their respiration was evaluated through the measurement of CO2 evolved as a result of the carbon mineralization, according to the titration method described by Anderson (1982) to determine the microbial activity. For the measurement of bacterial respiration, the O2/CO2 analyzer Oxybaby 6.0 was also used and at the end both results were compared. During the same incubation period, the microbial growth was analyzed by cell counting with Neubauer chamber and culture in plates with nutritive and Sabouraud agar, for bacteria and fungi respectively, as an indirect measure of the degradation of chlorpyrifos as the only carbon source. Thus, through microbial respiration and microbial growth, the potential bioremediation capacity of the isolated microorganisms over chlorpyrifos was evaluated, stablishing a viable alternative for the recovery of agricultural soils contaminated with this organophosphorus pesticide. Key words: chlorpyrifos, degradation, microbial respiration, soil, bioremediation. I. INTRODUCCIÓN La agricultura es una de las principales actividades productivas que se desarrollan en el Perú y en el mundo desde hace miles de años. Esta, se ve afectada por la presencia de diversas plagas y enfermedades que atacan los cultivos, resultando en pérdidas de las cosechas y en toda la inversión que estas conllevan. Para hacer frente a estas plagas, se empezaron a sintetizar y a emplear plaguicidas o pesticidas que ayudan a controlarlas o eliminarlas. Los pesticidas sintéticos cuya efectividad es demostrada, son producidos en cantidades masivas desde su introducción como control químico de plagas, entre finales de los años 30 e inicios de los años 40, y esta producción ha ido en aumento considerablemente a través de los años. Desde el inicio de la revolución industrial se estiman en más de 120,000 las sustancias químicas de nueva síntesis y los subproductos derivados de estas, producidos por la actividad humana, censo que incrementa día a día y que parece no tener fin si se considera que se incorporan a la lista cerca de 2000 nuevos compuestos cada año (Olea y Fernández, 2001). Actualmente existen alrededor de 100 diferentes ingredientes activos destinados a la fabricación de pesticidas y aproximadamente más de pesticidas formulados (productos registrados en SENASA hasta julio de 2017) en el Perú, entre los cuales se encuentran registrados 85 productos con el ingrediente activo clorpirifos. Según el SIGIA SENASA, para la primera mitad del año 2011, la importación de productos formulados a base de únicamente clorpirifos fue de kilogramos y litros; de litros en mezcla con otros ingredientes activos y de kilogramos como material técnico (ingrediente activo puro). A pesar de que muchos de los plaguicidas usados dentro del territorio nacional actualmente han sido prohibidos en otros países por su toxicidad; el número de plaguicidas registrados, importados, formulados y comercializados se incrementa cada año. Esto ha permitido que el número de productos que entran en contacto con la población y el ambiente, se incremente día a día. Cada plaguicida contiene uno o más ingredientes activos registrados para su uso en la agricultura, eso sin contar aquellos que se importan para uso particular sin necesidad de un registro y aquellos que se expenden sin ningún control de parte de la autoridad nacional, el Servicio Nacional de Sanidad Agraria - SENASA. El uso intensivo de pesticidas ha generado a lo largo de los años problemas en los sistemas biológicos y el ambiente en su entorno (Kanekar et al., 2004). Algunos de sus ingredientes activos son muy persistentes, poco solubles en agua y muy tóxicos, e incluso han sido reportadas sus propiedades mutagénicas, carcinogénicas y teratogénicas (Hayes, 1991, citado por Kalwasinska, 2008); así como el daño que ocasionan al sistema inmune (Culliney et al., 1992, citado por Kalwasinska, 2008), nervioso y/o al sistema endocrino (LeBlanc, 1995; Perreault et al., 1992; Nakai et al., 1993; Sarrif et al., 1994; citado por Kalwasinska, 2008). Uno de los grupos de pesticidas más utilizados es el grupo de los organofosforados, el cual representa más del 36 por ciento del mercado mundial total (Kanekar et al., 2004). Estos se desarrollaron en Alemania durante la segunda guerra mundial en la forma de tetraetil pirofosfato (TEPP), un subproducto en el desarrollo del gas nervioso. El ingrediente activo en estudio, clorpirifos (clorpirifos según registros del SIGIA SENASA 2016, también conocido como clorpirifos), es un insecticida no sistémico que pertenece al grupo de los organofosforados. Según EXTOXNET (1993), fue sintetizado a partir del año 1965 y actúa en los insectos como inhibidor de la colinesterasa con acción de contacto, estomacal y respiratoria. Se usa en la agricultura, horticultura, viticultura y silvicultura en un amplio rango de cultivos para el control de coleópteros, dípteros, homópteros y lepidópteros, aplicado tanto al follaje como al suelo. 2 Para EFSA (2005), clorpirifos tiene la característica de ser persistente en suelo con una vida media de 120 días y está categorizado como moderadamente tóxico (banda toxicológica amarilla) de acuerdo a su dosis letal oral media en ratas (LD50 oral = mg/kg pc), no es irritante para la piel, para los ojos ni es sensibilizante. Por otro lado, con respecto a la biorremediación se estima que es una tecnología que ha crecido rápidamente hasta convertirse en una tecnología aceptada para el tratamiento y control de una gran variedad de casos de contaminación con sustancias químicas peligrosas. La base de su crecimiento radica en su menor costo, comparado con el de otras técnicas como incineración o confinamiento. Además del beneficio económico, presenta la ventaja de degradar la mayor parte de la materia orgánica, minimizando los efectos patógenos sobre la salud y las complicaciones legales que pueden generarse cuando un contaminante es removido, pero no eliminado (Álvarez y Guevara, 2003). Debido al aumento progresivo en el uso de pesticidas, a que el mercado de agroquímicos es de gran interés mundial ya que, en términos de valor, se proyecta que alcance $ 250,5 billones para el año 2020 (Markets y Markets, 2015) y al hecho de que van a seguir usándose en todo el mundo ya que son necesarios pues la población mundial crece a tasas exponenciales y aún no se han planteado alternativas que igualen su nivel de uso y que sean económicamente viables, la biorremediación se presenta como una buena opción para el tratamiento y la degradación de estas moléculas en el suelo ya que los microorganismos son capaces de utilizar, en su metabolismo, numerosos compuestos; mineralizándolos y detoxificando (Kanekar et al., 2004). 3 II. REVISIÓN DE LITERATURA 2.1 PLAGUICIDAS DEFINICIÓN Según la FAO (2006), un pesticida o plaguicida es cualquier sustancia o mezcla de sustancias destinadas a prevenir, destruir o controlar cualquier plaga, incluyendo los vectores de enfermedades humanas o de los animales, las especies no deseadas de plantas o animales que causan perjuicio o que interfieren de cualquier otra forma en la producción, elaboración, almacenamiento, transporte o comercialización de alimentos, productos agrícolas, madera y productos de madera o alimentos para animales, o que pueden administrarse a los animales para combatir insectos, arácnidos u otras plagas en o sobre sus cuerpos e incluyendo reguladores de crecimiento y sustancias aplicadas a los cultivos antes o después de la cosecha para proteger el producto contra la deterioración durante el almacenamiento y transporte CLASIFICACIÓN Los plaguicidas pueden clasificarse siguiendo diferentes criterios: De acuerdo a su organismo objetivo: insecticidas, fungicidas, acaricidas, bactericidas, nematicidas, herbicidas, rodenticidas o molusquicidas. De acuerdo al grupo químico del principio activo: Compuestos organofosforados, compuestos carbamatos, compuestos organoclorados, piretroides, derivados del bipiridilo, triazinas, tiocarbamatos, derivados del ácido fenoxiacético, derivados de la cumarina, derivados del cloronitrofenol, compuestos organomercuriales, entre otros. De acuerdo a su toxicidad aguda (OMS): Esta se basa principalmente en la toxicidad por vía oral y dérmica en ratas y ratones. Usualmente la dosis se registra como el valor DL50 (Dosis Letal Media) que es la dosis requerida para matar al 50 por ciento de la población de animales de prueba y se expresa en términos de mg/kg de peso del cuerpo del animal EFECTOS DEL USO INTENSIVO DE LOS PLAGUICIDAS a. Efectos en el suelo Contaminación del suelo: Los pesticidas entran en el suelo a través de la deriva de pulverización durante el tratamiento del follaje, el lavado del follaje tratado, la liberación de productos granulados o de semillas tratadas en el suelo. Algunos pesticidas tales como fumigantes del suelo y nematicidas se aplican directamente en el suelo para controlar las plagas y enfermedades de las plantas que se presentan en el suelo. El transporte, la persistencia o la degradación de los plaguicidas en el suelo dependen de sus propiedades químicas, así como características físicas, químicas y biológicas del suelo. Todos estos factores afectan la adsorción / desorción, volatilización, la degradación, la absorción por las plantas, la escorrentía y la lixiviación de pesticidas (PAN Europe, 2010). b. Efectos en el agua Contaminación del agua: Los pesticidas pueden entrar en el agua a través de la deriva durante la fumigación con estos, por la escorrentía de la zona tratada o lixiviación a través del suelo. En algunos casos los plaguicidas se pueden aplicar directamente sobre la superficie del agua, por ejemplo, para el control de 5 mosquitos. La contaminación del agua depende principalmente de la naturaleza de los pesticidas (solubilidad en agua, hidrofobia), las propiedades del suelo, condiciones climáticas, el paisaje y también en la distancia de un punto de aplicación a una fuente de agua. El transporte rápido a las aguas subterráneas puede ser causado por las fuertes lluvias en breve después de la aplicación del plaguicida a suelos húmedos (PAN Europe, 2010). c. Efectos en los microorganismos Los microorganismos del suelo son esenciales para el mantenimiento de la estructura del suelo, la transformación y la mineralización de la materia orgánica, haciendo que los nutrientes estén disponibles para las plantas. Los microorganismos del suelo también son capaces de metabolizar y degradar una gran cantidad de contaminantes y pesticidas y por lo tanto su uso en la biotecnología es causa de interés (PAN Europe, 2010). Los microorganismos son vitales para la fertilidad del suelo y para la degradación de materia orgánica y contaminantes en el suelo (Liebich et al., 2003). Los pesticidas causan efectos adversos en la microbiota del suelo. Entre algunos casos tenemos, por ejemplo, fungicidas como pencycuron, que resultó ser tóxico para los hongos naturales y actinomicetos presentes en el suelo que incluso tuvieron una pequeña significancia ecológica (Liebich et al., 2003), mientras que Kinney et al., 2005; demostraron que los pesticidas clorotalonil y carbendazim también son tóxicos que intervienen en los procesos bacterianos de nitrificación y desnitrificación y en el año 2009, Lang & Cai demostraron que el uso de pesticidas puede influenciar la producción y el flujo neto de trazas de gases radioactivos de importancia ambiental y que los pesticidas mancozeb, clorotalonil y prosulfuron inhiben la producción de N2O y NO producido por los procesos de nitrificación y desnitrificación. En general, los pesticidas no solo interactúan con la enfermedad, plaga o maleza objetivo sino también con el ecosistema alrededor de su aplicación, perjudicando 6 organismos no blanco, como las abejas, invertebrados como los gusanos de tierra, arañas, micro-artrópodos, entre otros. Por otro lado, los plaguicidas pueden llegar a fuentes de agua a través de la deriva o la escorrentía. La mayoría de plaguicidas son tóxicos para organismo acuáticos ya que estos ecosistemas son más susceptibles al daño y a los cambios en l
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