IDENTIFICACIÓN DE CULTIVARES Y LÍNEAS DE MEJORAMIENTO DE ARROZ DE CHILE MEDIANTE AMPLIFICACIÓN DE FRAGMENTOS POLIMÓRFICOS (AFLP)

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INVESTIGACIÓN IDENTIFICACIÓN DE CULTIVARES Y LÍNEAS DE MEJORAMIENTO DE ARROZ DE CHILE MEDIANTE AMPLIFICACIÓN DE FRAGMENTOS POLIMÓRFICOS (AFLP) Identification of Chilean rice cultivars and breeding lines
INVESTIGACIÓN IDENTIFICACIÓN DE CULTIVARES Y LÍNEAS DE MEJORAMIENTO DE ARROZ DE CHILE MEDIANTE AMPLIFICACIÓN DE FRAGMENTOS POLIMÓRFICOS (AFLP) Identification of Chilean rice cultivars and breeding lines by means of Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) Carlos Aguirre 1, Roberto Alvarado 2 y Patricio Hinrichsen 1* A B S T R A C T Twelve rice (Oryza sativa L.) cultivars and breeding lines developed by the Rice Breeding Program at the National Institute of Agriculture Research (INIA), Quilamapu Regional Research Center, were genetically characterized by amplified fragment length polymorphism (AFLP). Sixteen of 21 primer combinations evaluated were informative, generating a total of 667 amplicons, 94 of them polymorphic (14.4%), with a range between 9 to 33% of polymorphism per primer combination. This indicates that the material handled by the breeding program at INIA has low genetic diversity in comparison to wild germplasm of the species, or even compared to the material managed by other rice breeding programs. The detected polymorphic amplicons were used to prepare a dendrogram of the genetic distances, detecting four differentiable groups that only partially coincide with the information available in their pedigrees. In spite of the low genetic diversity detected, it was determined that with the use of three AFLP+3 combinations (PE1G/PM1I, PE1H/PM1A and PE1G/PM1H), it is possible to differentiate among the cultivars studied. Key words: genetic diversity, fingerprinting, AFLP, pedigree, Chilean rice varieties. R E S U M E N Doce cultivares y líneas de arroz (Oryza sativa L.) desarrollados por el programa de fitomejoramiento del Instituto de Investigaciones Agropecuarias (INIA), Centro Regional de Investigación Quilamapu, fueron caracterizados genéticamente mediante amplificación de fragmentos polimórficos (AFLP). De 21 combinaciones ensayadas, sólo 16 fueron informativas, generando un total de 667 amplicones, 94 de ellos polimórficos (14,4%), con un rango entre 9 y 33% de polimorfismo por combinación. Esto indica que el material manejado por el programa de INIA presenta un bajo nivel de diversidad genética comparado tanto con germoplasma silvestre de la especie como con aquel usado por otros programas de fitomejoramiento de la especie. Los amplicones polimórficos detectados se usaron para preparar un dendrograma de distancias genéticas, detectándose cuatro grupos diferenciables que sólo coinciden parcialmente con la información disponible de sus pedigrís. A pesar de la baja diversidad genética detectada, se determinó que con el uso de tres combinaciones de partidores de AFLP+3 (PE1G/PM1I, PE1H/PM1A y PE1G/PM1H) es posible discriminar entre los cultivares estudiados. Palabras clave: diversidad genética, fingerprinting, AFLP, pedigrí, cultivares chilenos de arroz. 1 Instituto de Investigaciones Agropecuarias, Centro Regional de Investigación La Platina, Casilla 439/3, Santiago, Chile. *Autor para correspondencia. 2 Instituto de Investigaciones Agropecuarias de Chile, Centro Regional de Investigación Quilamapu, Casilla 426, Chillán, Chile. Recibido: 29 de abril de Aceptado: 24 de noviembre de AGRICULTURA TÉCNICA (CHILE) 65(4): (OCTUBRE-DICIEMBRE 2005) C. AGUIRRE et al. - IDENTIFICACIÓN DE CULTIVARES Y LÍNEAS DE MEJORAMIENTO DE ARROZ DE INTRODUCCIÓN El arroz (Oryza sativa L.) fue introducido al país en la década de 1920; en el censo de 1938 se describía una superficie sembrada de casi ha (Hepp, 1945), la que a fines de la década de 1970 estaba en el orden de las ha. En los últimos años se ha mantenido estable en torno a las ha (ODEPA, 2004). Este cultivo tradicionalmente es asociado a regiones tropicales y subtropicales del planeta, existiendo también materiales que se han adaptado a latitudes más septentrionales, de clima templado, con inviernos fríos y veranos secos y calurosos, como la Zona Central de Chile (IRRI, 1983). Estas condiciones ambientales y la ausencia de patógenos importantes han permitido que los cultivares chilenos permanezcan vigentes por períodos prolongados, lo que también se verifica en otros países con similar clima, como Australia, y marca una diferencia con países tropicales. En el caso de Chile, la producción se ve afectada por factores agroclimáticos, de manejo y calidad de grano. Consecuentemente, los objetivos del programa de mejoramiento del cultivo son mejorar el rendimiento, la calidad del grano y la resistencia al frío (Alvarado y Grau, 1991). Se ha sugerido que los cultivares chilenos de arroz tienen una elevada homogeneidad genética, lo que ha sido documentado en base a marcadores moleculares de ADN (amplificación de fragmentos de ADN en base a partidores de diseño aleatorio, o RAPD) y a patrones electroforéticos de las proteínas de acúmulo de la semilla (Hinrichsen et al., 1996). En parte, esto se explicaría por tener un fondo genético estrecho, debido a la participación de un escaso número de progenitores, como Oro (Anónimo, 1964) y Diamante (Alvarado y Pino, 1982). No se sabe con certeza, pero se estima que el arroz llegó a Chile desde Italia (Alvarado, 1989) en los primeros decenios del siglo pasado, y la selección de plantas sobre la población heterogénea existente en el país dio origen a las primeras variedades, como la mencionada var. Oro. Desde sus inicios, el programa de mejoramiento ha trabajado con incorporación de germoplasma desarrollado en otros países (Alvarado, 1997). Una segunda variedad importante es Diamante, que fue generada por el método de pedigrí a partir de una progenie F 2 introducida desde Perú (Alvarado y Pino, 1982). Una de las características de este programa es que desde sus inicios se basó en pocos progenitores, lo que sugiere a priori que debería presentar un estrecho fondo genético. Sin embargo, si los progenitores aunque escasos eran de diversos orígenes, podrían tener una diversidad genética más alta que lo sospechado, lo que constituye una hipótesis alternativa. El estudio de la diversidad genética del germoplasma de arroz y las diferencias genéticas entre potenciales progenitores ha sido de gran interés para el manejo de los programas de fitomejoramiento, como para los involucrados en cualquiera de las etapas del proceso productivo y su control, incluyendo a quienes registran y regulan la distribución de semillas comerciales, los propios productores que deben elegir la semilla adecuada y los empresarios molineros y distribuidores. Actualmente es de alto interés tener herramientas analíticas adecuadas para establecer la identidad genética de los cultivares, y para determinar el nivel de pureza de las semillas (Staub y Meglic, 1993). Esta identificación se ha basado tradicionalmente en la caracterización agronómica y morfológica de las semillas y plantas, lo que ha evolucionado en el último decenio hacia el uso de diversos tipos de marcadores moleculares que permiten identificar polimorfismos o diferencias a nivel de secuencias de ADN, permitiendo comparar clones, cultivares o variedades botánicas, razas, especies, o cualquier nivel de organización taxonómica, tanto en plantas como en animales y microorganismos. Con diversos propósitos se han usado métodos bioquímicos en arroz, como el análisis electroforético de las proteínas de la semilla (Aliaga-Morel et al., 1987), lo que, como en otras especies de cereales, se ha hecho principalmente mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) (Hussain et al., 1989). Los perfiles isoenzimáticos también han sido útiles para la clasificación de germoplasma de arroz (Second, 1982; Glaszmann, 1987). Sin embargo, estas técnicas son por lo general difíciles de estandarizar y poseen una baja capacidad discriminante. Tanto los métodos que analizan las proteínas (una forma de expresión fenotípica) como los análisis agronómico-botánicos han sido complementados por alguna de las diversas formas de análisis del genoma, especialmente por métodos basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Saiki et al., 1988). Además, ha sido posible automatizar estas técnicas, lo cual permite disponer de metodologías rápidas y eficientes para analizar un gran número de muestras en breve plazo. 358 AGRICULTURA TÉCNICA - VOL N o La importancia del cultivo del arroz en el mundo es proporcional a la gran cantidad de trabajos que han recurrido a estas herramientas moleculares para distintos tipos de análisis genético en esta especie. Es así como RAPD, técnica basada en la amplificación de fragmentos de ADN mediante PCR por medio de partidores de secuencia aleatoria (Welsh y McClellan, 1990; Williams et al., 1990), ha sido descrita en varios estudios para diferenciar cultivares de arroz (Fukuoka et al., 1992; Yu y Nguyen, 1994; Hinrichsen et al., 1996). Sin embargo, RAPD tiene un limitado nivel de reproducibilidad, lo que ha llevado a que su uso se prefiera más bien para estudios comparativos de colecciones de germoplasma. Posterior al RAPD se desarrolló el AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), método altamente sensible para detectar polimorfismos de ADN (Vos et al., 1995), que combina una digestión enzimática con una amplificación por PCR. Su ventaja es que entrega patrones de información con un mayor número de amplicones y de mayor reproducibilidad que RAPD, y como otros marcadores de tipo anónimo, no requiere información previa del genoma en estudio. Se han descrito diversas aplicaciones de AFLP para estudios genéticos de arroz, entre los cuales destacan los análisis de identidad de cultivares y de diversidad genética de genotipos de diversos orígenes (Mackill et al., 1996; Singh et al., 1998; Zhu et al., 1998; Aggarwal et al., 2002), mapeo de ligamiento (Mackill et al., 1996; Virk et al., 1998; Dong et al., 2000), análisis filogenéticos entre ancestros de la especie cultivada y sus subespecies principales indica y japonica (Aggarwal et al., 1999), y mejoramiento genético asistido por marcadores (Joseph et al., 2004), entre otros. El objetivo de este trabajo fue desarrollar un método de identificación varietal o fingerprinting molecular basado en AFLP de 12 cultivares y líneas avanzadas de arroz, así como usar la información generada para estimar la magnitud de la diversidad genética presente en esta subcolección del germoplasma manejado por el programa de fitomejoramiento del arroz del Centro Regional de Investigación Quilamapu de INIA. MATERIALES Y MÉTODOS Cultivares estudiados El material empleado para la extracción de ADN fueron hojas de plántulas jóvenes de 12 cultivares chilenos de arroz, cuyo pedigrí se indica en el Cuadro 1. Las plántulas se obtuvieron germinando semillas en cámara húmeda, bajo condiciones de humedad y temperatura controladas. Extracción de ADN La extracción de ADN se realizó desde hojas frescas germinadas durante 25 días en cámara húmeda regulada a 25ºC y se basó en el método del bromuro de cetril-trimetil amonio (CTAB) descrito por Rogers y Bendich (1988), con modificaciones menores Las hojas se molieron en un mortero con N 2 líquido y se incubaron en 700 µl de tampón de extracción CTAB 2X (CTAB 2%, NaCl 1,4 M, Tris- HCl 100 mm, EDTA 25 mm [ph 8,0], PVP 2% y 1/ 100 vol. de β-mercaptoetanol) a 65ºC por 20 min, agitando cada cierto tiempo. La mezcla se dejó enfriar a temperatura ambiente y luego se agregó 1 vol. de cloroformo:alcohol isoamílico (24:1) y se agitó en vórtex por 30 s. Para separar las fases se centrifugó a r.p.m. por 15 min y se transfirió la fase acuosa a otro tubo, agregándosele 1/10 vol. de CTAB 10%. Se repitió la extracción orgánica con cloroformo y se recuperó la fase acuosa, a la que se le agregó 1 vol. de CTAB de precipitación, mezclando por inversión. Se centrifugó por 10 min a r.p.m. y se eliminó el sobrenadante. El sedimento se hidrató en 250 µl de TE (10 mm Tris- HCl [ph 8,0], 1 mm EDTA) conteniendo NaCl 1 M. Se dejó reposar hasta disolver el sedimento y se agregó RNAsa A (Sigma, St. Louis, Missouri, EE.UU.) a una concentración final de 20 µg ml -1. Se incubó a 37ºC por 20 min y se agregaron 2,5 vol. de etanol absoluto frío, dejando reposar a -70ºC por 20 min. Se centrifugó por 10 min a r.p.m. y se eliminó el sobrenadante. El precipitado se lavó con etanol al 70% y se centrifugó por 2 min a r.p.m. El precipitado final se secó al vacío y se rehidrató en 50 µl de TE. Las muestras de ADN concentrado se re-centrifugaron posteriormente, para descartar posibles residuos de polisacáridos. La integridad y rendimiento del ADN genómico se observó en un gel de agarosa al 0,8% en TBE 1X (Tris 10 mm, Borato 20 mm, EDTA 1 mm), teñido con bromuro de etidio. La calidad del ADN obtenido fue adecuada para las digestiones con enzimas de restricción que requiere el AFLP. Partidores de PCR y adaptadores Los partidores para la reacción +1 fueron: EcoRI +1: 5'-GAC TGC GTA CCA ATT CA-3'; MseI +1: 5'-GAT GAG TCC TGA GTA AG-3' (IDT Inc., C. AGUIRRE et al. - IDENTIFICACIÓN DE CULTIVARES Y LÍNEAS DE MEJORAMIENTO DE ARROZ DE Cuadro 1. Cultivares y líneas de arroz estudiadas y su respectivo pedigrí (se indica el nombre abreviado de cada cultivar en la segunda fila). Los valores indican los aportes teóricos de cada progenitor indicado a la izquierda, como fracción del genoma de cada cultivar obtenido. Para los cvs. Oro y Tuc-500 no se cuenta con información de pedigrí (asteriscos). Table 1. Cultivars and breeding lines studied and their respective pedigree (abbreviated name of each cultivar in the second line). The values indicate the theoretical participation of each progenitor (listed at the left), as a fraction of the genome of each cultivar obtained. There is no pedigree data for cvs. Oro and Tuc-500 (asterisks). Signo (-) indica que no hay relación filial entre un progenitor (columna de la izquierda) y un cultivar o línea analizado en este trabajo (fila superior); s/i: sin información de pedigrí. (-) denotes there is no parent-offspring relation between the progenitors (left column) and any of the cultivars or lines analyzed here (upper line); s/i: no pedigree available. 360 AGRICULTURA TÉCNICA - VOL N o Coralville, Iowa, EE.UU.). Los partidores para la reacción +3 tienen la misma secuencia que los +1, con dos nucleótidos adicionales hacia el extremo 3, según se indica en el Cuadro 2. Los adaptadores empleados fueron los siguientes, alineados de acuerdo a lo descrito por Vos et al. (1995): Adaptador EcoRI: 5'- CTCGTAGACTGCGTACC CTGACGCATGGTTAA-5' Adaptador MseI: 5'- GACGATGAGTCCTGAG TACTCAGGACTCAT-5' Reacción de AFLP La reacción de AFLP se realizó de acuerdo al protocolo de Vos et al. (1995), con algunas modificaciones. Primero, la digestión del ADN se realizó en un volumen total de 25 µl: 0,2 µg de ADN genómico con 2,5 U de EcoRI y 2,5 U de MseI (New England Biolabs, Maryland, EE.UU.), 2,5 µl de tampón NEB2 10X (NaCl 500 mm, Tris-HCl 100 mm [ph 7,9], MgCl mm, DTT 10 mm), a 37ºC por 3 h. En segundo lugar, la ligación de adaptadores se efectuó en una reacción que contenía 2,5 pmol de adaptador EcoRI, 25 pmol de adaptador MseI, 3,0 µl de tampón de ligasa 10X (Tris-HCl 500 mm [ph 7,8], MgCl mm, DTT 100 mm, ATP 10 mm, 50 µg ml -1 de BSA) y 100 U de ADN ligasa T4 (New England Biolabs), en un volumen final de 5 µl. Esta mezcla se agregó al ADN digerido y se incubó toda la noche con ciclos de 30 s, oscilando entre 10 y 30ºC. Las amplificaciones se realizaron en dos etapas. En la primera (PCR +1), la mezcla de reacción contenía 5 µl de una dilución 1/10 de la mezcla de ligación, 75 ng de cada partidor más MgCl 2 (1,2 mm), dntp (0,2 mm), 0,5 U de ADN polimerasa Taq y tampón de PCR (Tris-HCl 10 mm [ph 8,3], KCl 50 mm, y 0,01% de gelatina) en un volumen final de 50 µl. El programa de amplificación utilizado fue de 94ºC por 2 min; 35 ciclos de 94ºC por 30 s, 55 C por 30 s y 72 C por 1 min, con una extensión final de 5 min a 72ºC. Finalmente, para la amplificación selectiva (PCR +3) se mezclaron 5 µl de una dilución 1/10 del PCR +1 con 30 ng de cada partidor, dntp (0,8 mm final), MgCl 2 (2 mm final), tampón de PCR (Tris-HCl 10 mm [ph 8,3], KCl 50 mm, y gelatina 0,01%) y 0,5 U de ADN polimerasa Taq en un volumen final de 20 µl. El programa de amplificación +3 fue una desnaturación inicial de 94ºC por 3 min, 12 ciclos de 94 C por 30 s, 65 C por 30 s (disminuyendo 0,7 C por ciclo hasta llegar a 56ºC) y 72 C por 1 min. Luego, 26 ciclos de 94 C por 30 s, 56 C por 30 s y 72 C por 1 min, finalizando con una extensión de 2 min a 72ºC. Electroforesis y tinción del gel Los productos de la amplificación PCR +3 se concentraron a 1/3 de su volumen mediante centrifugación al vacío y se mezclaron con 1 vol. de tampón de Cuadro 2. Combinaciones de partidores EcoRI +3 (columna de la izquierda) y MseI +3 (fila superior) usados en el análisis de 12 genotipos de arroz. Se indica la nomenclatura resumida de los partidores (PE1A, PE1B, PE1C, etc.) y los nucleótidos adicionales respectivos, así como el nivel de polimorfismo observado para 21 de las 48 posibles combinaciones. Table 2. EcoRI +3 (left column) and MseI +3 (upper row) primer combinations used in the analysis of 12 rice genotypes. Brief primer names (PE1A, PE1B, PE1C, etc.) and their corresponding additional nucleotide sequences as well as the polymorphism level observed for 21 out of 48 possible combinations are indicated. n/e: indica que la combinación de AFLP respectiva no fue ensayada. : símbolo que denota el nivel de poliformismo de cada combinación de partidores:, 8 ó más bandas polimórficas (b. polim.);, 5 a 7 b. polim.;, 2 a 4 b. polim; 0, ausencia de polimorfismos. n/e: non assayed AFLP combinations. : denotes the polymorphic level of each AFLP combination:, 8 or more polymorphic bands (polym. b.);, 5 to 7 polym. b.;, 2 to 4 polym. b.; 0, no polymorphisms detected. C. AGUIRRE et al. - IDENTIFICACIÓN DE CULTIVARES Y LÍNEAS DE MEJORAMIENTO DE ARROZ DE carga (95% de formamida, EDTA 10 mm [ph 8,0], y azul de bromofenol y xylen cyanol a 1 mg ml -1 cada uno). Las muestras se desnaturaron a 90 C por 4 min y luego se enfriaron en hielo. Las muestras (entre 1 y 3 µl) se cargaron en un gel de secuencia de poliacrilamida al 6%, conteniendo urea (7,5 M) preparada en TBE 1X. El gel se fijó a uno de los vidrios usando Bind-Silane A (Promega, Madison, Wisconsin, EE.UU.), mientras que el otro vidrio se trató con Repel-Silane ES (Pharmacia-Biotech, Rochester, New York, EE.UU.). La electroforesis se corrió a 70 W y 1800 V por 2,5 h, aproximadamente. El gel se fijó sumergiendo el vidrio que lo contenía en ácido acético al 10% por 30 min con agitación; después de dos lavados rápidos en agua destilada, el gel se transfirió a la solución de tinción (0,1% de AgNO 3 y 1,5 ml L -1 de formaldehído al 37%) y se mantuvo con agitación por 30 min. Luego se reveló sumergiéndolo en una solución de revelado (3% de NaCO 3, 2 mg L -1 de tiosulfato de sodio anhidro y 1,5 ml L -1 de formaldehído al 37%) hasta la aparición de los fragmentos de amplificación, antes que la tinción de fondo del propio gel interfiriera. La tinción se detuvo con un exceso de ácido acético al 10% y finalmente se lavó por 30 min en agua destilada. Análisis de datos Los fragmentos de ADN polimórficos se compilaron en una matriz de datos binarios con los cuales se calcularon índices de similitud genética relativos usando el paquete estadístico NTSys-PC 2.03 (Rohlf, 1997), usando el índice de Jaccard para los cálculos de distancias genéticas. La formación de clados para construir el dendrograma se realizó con el índice Simple Matching, realizando los agrupamientos en base al estadígrafo UPGMA (pares matemáticos de peso estadístico no balanceado). RESULTADOS Y DISCUSIÓN Diversidad genética de cultivares chilenos de arroz determinada mediante AFLP y comparación con otros estudios La diversidad genética (DG) de esta muestra de 12 genotipos del programa de mejoramiento genético se evaluó mediante el uso de 21 combinaciones de partidores de AFLP (Cuadro 2), de las cuales 16 fueron informativas. Estas 16 combinaciones generaron un total de 667 fragmentos de ADN amplificados (amplicones), de las cuales sólo 94
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