Efeito de Bactérias Endofíticas no Controle de Meloidogyne incognita e sua Capacidade de Colonização de Raízes de Tomateiro

Please download to get full document.

View again

of 7
All materials on our website are shared by users. If you have any questions about copyright issues, please report us to resolve them. We are always happy to assist you.
Categories
Published
Efeito de Bactérias Endofíticas no Controle de Meloidogyne incognita e sua Capacidade de Colonização de Raízes de Tomateiro
  54Vol. 33(1) - 2009 Renata S.C. Pinho, Vicente P. Campos, Ricardo Magela de Souza, Juliana R.C. Silva, Márcia S. Oliveira, Giselle C.S. Pimentel & Lílian S.A.S. Costa  Efeito de Bactérias Endofíticas no Controle de Meloidogyne incognita e suaCapacidade de Colonização de Raízes de Tomateiro Renata S.C. Pinho 1 *, Vicente P. Campos 1 , Ricardo Magela de Souza 1 , Juliana R.C. Silva 2 , Márcia S. Oliveira 1 ,Giselle C.S. Pimentel 1  & Lílian S.A.S. Costa 1 1 Departamento de Fitopatologia, Universidade Federal de Lavras, C. Postal 3037, 37200-000 Lavras (MG) Brasil.²Campos Carregal Pesquisa e Tecnologia Agrícola Ltda., Rua CL3, Quadra C, Lote 23 – Residencial Lausane, 75907-454 Rio Verde (GO) Brasil.*Autora para correspondência: canutors@yahoo.com.brRecebido para publicação em 06 / 06 / 2008. Aceito em 29 / 09 / 2008Editado por Claudio Marcelo Oliveira Resumo – Pinho, R.S.C., V.P. Campos, R.M. Souza, J.R.C. Silva, M.S. Oliveira, G.C.S. Pimentel & L.S.A.S.Costa. 2009. Efeito de bactérias endofíticas no controle de  Meloidogyne incognita e sua capacidade de colonizaçãode raízes de tomateiro.Objetivou-se neste trabalho avaliar o efeito de bactérias endofíticas na reprodução de  Meloidogyne incognita   esua capacidade de colonização de raízes de tomateiro, pela técnica do Phytagel ® . Para isso, sementes de tomateiroforam microbiolizadas em suspensões bacterianas ajustadas para OD 540 = 0,5 por 24 horas. A seguir essassementes foram semeadas em copos de 300 cm 3  com substrato Plantmax ® . Após quinze dias, as mudas foraminoculadas com 400 ovos de  M. incognita.  Trinta dias após a inoculação, avaliou-se o número de galhas, massasde ovos e ovos por grama de raiz. No ensaio de colonização, as sementes microbiolizadas em suspensõesbacterianas foram colocadas para germinar em tubos de ensaio esterilizados contendo Phytagel ® . Os tubosforam mantidos em câmara de crescimento sem luz, a 28 ºC. As avaliações consistiram de inspeções diáriaspara detectar a formação do crescimento bacteriano. As espécies  Acinetobacter johnsonii (T9 e T10), Curtobacterium luteum (P16), Bacillus pumilus subg. B (T27), B. pumilus (T26) e B. amyloliquefaciens (T36) proporcionaram o melhorcontrole de  M. incognita  , as quais também colonizaram as raízes de tomateiro. Palavras chaves: controle biológico, nematóide das galhas, colonização de raízes. Summary  - Pinho, R.S.C., V.P. Campos, R.M. Souza, J.R.C. Silva, M.S. Oliveira, G.C.S. Pimentel & L.S.A.S.Costa. 2009. Effect of endophytic bacteria on the control of  Meloidogyne incognita and their capacity of rootcolonization of tomato. This work aimed to evaluate the effect of bacteria on the reproduction of  Meloidogyne incognita   and theircapacity to colonize the tomato root using the Phytagel ®  technique. Tomato seeds were embedded into bacterialsuspension OD 540 = 0.5 for 24 hours. Then, the inoculated seeds were sown in 300 cm 3  cups filled withPlantmax ® substract. Fifteen days later, seedlings were inoculated with 400 eggs of  M. incognita.  Thirty dayslater, the numbers of galls, egg-masses and eggs per gram of roots were evaluated. For the colonization assay,the tomato seeds were embedded in bacterial suspension and then placed to germinate in sterile tubes withPhytagel ® . The tubes were kept in growth chamber without light, at 28 °C. The tubes were checked daily forbacterial growth. The species that gave better control of  M. incognita  were:  Acinetobacter johnsonii (T9 e T10), Curtobacterium luteum (P16), Bacillus pumilus subg. B (T27), B. pumilus (T26) e B. amyloliquefaciens (T36), which alsocolonized the tomato roots. Key words : biological control, root-knot nematodes, root colonization.    ARTIGO  Nematologia BrasileiraPiracicaba (SP) Brasil55  Efeito de Bactérias Endofíticas no Controle de Meloidogyne incognita e sua Capacidade de Colonização de Raízes de Tomateiro Introdução  A busca por bactérias antagonistas afitonematóides tem se intensificado nas últimasdécadas, com maior ênfase para as endofíticas, já quetêm capacidade de colonizar os tecidos internos dohospedeiro e promoverem o crescimento de plantas(PGPR) (Siddiqui et al.  2003). Vários métodos têmsido empregados no estudo in vitro  da colonização deraízes por bactérias, como o uso de Phytagel ®  (Queiroz et al. , 2006), ágar Noble (Habe et al. , 2000) e ágar-ágar(Romeiro et al. , 1999). Devido à sua simplicidade, essesmétodos facilitam a seleção de um grande númerode isolados rizobacterianos (Queiroz et al. , 2006). Silva et al.  (2003) constataram boa relação entre colonizaçãode raízes e eficiência no controle de bactériasfitopatogênicas. Segundo Freitas (2003), para que umarizobactéria seja eficiente em condições reais decultivo, ela deve colonizar o sistema radicular da plantahospedeira e ser capaz de competir com bactériasnativas dos mais diversos tipos de solos. Visando ampliar o conhecimento sobre o espectrode ação das bactérias endofíticas em estudo e investigarsua relação com raízes, objetivou-se neste trabalhoavaliar o efeito dessas bactérias na reprodução de  Meloidogyne incognita   (Kofoid & White) Chitwood e arelação desse antagonismo com a capacidade decolonização de raízes de tomateiro (  Solanum lycopersicum  L.) pela técnica do Phytagel. Material e Métodos Efeito de isolados bacterianos endofíticos nonúmero de galhas, massas de ovos e ovos porgrama de raiz de tomateiro. Para realização dosensaios foram utilizados 39 isolados ou espécies debactérias endofíticas obtidas em trabalho anterior deSilva (2004), isoladas de caules e hastes de tomateiro epimentão (  Capsicum annum   L.). Preparo do inóculo bacteriano. Os isoladosforam preservados em meio líquido peptona-glicerolem  freezer   a - 80 ºC e transferidos para as placas dePetri contendo meio Trypic Soy Agar   (TSA) e incubadosa 28 ºC em câmara de crescimento (BOD). Após 48horas, foram preparadas suspensões bacterianas,adicionando-se às placas solução salina de NaCl a 0,85% e homogeneizando-as com uma alça de Drigalsky. A concentração das suspensões foi ajustada, emespectrofotômetro, para OD 540 = 0,5 (10 8  ufc / m l   ). Obtenção dos ovos de Meloidogyne incognita.   O inóculo foi preparado com suspensãode ovos de  M. incognita extraídos de raízes detomateiro (  Solanum lycopersicum L. ‘Kada’),   mantidas em vaso contendo solo esterilizado, em condições de casade vegetação, conforme metodologia de Hussey &Barker (1973). Montagem e avaliação dos ensaios. Sementesde tomateiro ‘Kada’ foram esterilizadassuperficialmente pela imersão em etanol (50 %) por30 segundos, em seguida hipoclorito de sódio (2 %)por 3 minutos, seguidas de três lavagens em águaesterilizada. Essas sementes foram microbiolizadas em5 m l   de cada suspensão bacteriana por 24 horas ecolocadas para germinar em copos plásticos, com volume de 300 cm 3 , contendo substrato Plantmax ® .Em seguida, os copos foram levados para salaclimatizada com temperatura de 27 ºC (± 2) efotoperíodo de 12 h. Quinze dias após a semeadura,foram inoculados 400 ovos de  M. incognita   em soluçãoaquosa em cada copo, em dois orifícios de 2 cm deprofundidade no substrato, próximos ao colo daplântula, feitos com um bastão de vidro. Trinta diasapós a infestação do substrato com os ovos donematóide, avaliaram-se as seguintes variáveis: matériafresca do sistema radicular, número de galhas, massasde ovos e ovos por grama de raiz. Cada planta foiretirada cuidadosamente e cortada na altura do coletopara separação da parte aérea e raízes. Após separadasda parte aérea, as raízes foram cuidadosamente lavadasem água parada e secas com papel absorvente, sendoem seguida pesadas. A contagem do número de galhasfoi feita visualmente em todo o sistema radicular. Paracontagem de massas de ovos foi realizada a coloraçãoem solução contendo corante artificial empregado nafabricação de sucos, conforme a técnica descrita porRocha et al. (2005). Todo sistema radicular foi cortadoem pedaços de 0,5 cm de comprimento e os ovosextraídos pela técnica de Hussey & Barker (1973). Osovos foram quantificados em caixa de contagemreticulada em microscópio estereoscópico. Osnúmeros totais de galhas, massas de ovos e ovosforam divididos pelo peso da matéria fresca do sistemaradicular, calculando-se, então, o número de galhas,massas de ovos e ovos / grama de raiz.  56Vol. 33(1) - 2009 Renata S.C. Pinho, Vicente P. Campos, Ricardo Magela de Souza, Juliana R.C. Silva, Márcia S. Oliveira, Giselle C.S. Pimentel & Lílian S.A.S. Costa  Delineamento experimental. Os tratamentosforam dispostos em delineamento de blocoscasualizados, com três repetições. Os dados relativosa número de galhas, massas de ovos e ovos por gramade raiz foram transformados em  5,0 +  x  . A análisede variância e as médias de cada tratamento foramagrupadas pelo teste de Scott & Knott (1974), ao nívelde 5 % de significância. Colonização de raízes de tomateiros combactérias endofíticas. Empregaram-se os mesmosisolados bacterianos utilizados no ensaio anterior, bemcomo o mesmo método de preparo, concentraçãodo inóculo e esterilização das sementes. As sementesde tomateiro ‘Kada’ foram microbiolizadas em 5 m l  de suspensão bacteriana por 24 h, e colocadas paragerminar em tubos de ensaio esterilizados contendoPhytagel ®  (0,8 %), conforme descrito por Queiroz et al  . (2006). Os tubos foram mantidos em câmara decrescimento sem luz, a 28 ºC. O ensaio foi dispostoem delineamento inteiramente casualizado, com quatrorepetições.Diariamente cada tubo foi colocado sobre umfundo com luz fluorescente até que fosse observadaa colonização radicular pela bactéria. Uma camadade aspecto leitoso contrastando com o meio Phytagel ® ao longo do sistema radicular do tomateiro emformação indicava crescimento bacteriano, recebendoo sinal de (+). Quando não se observou tal camada,considerou-se que o crescimento bacteriano nãoocorreu e assim recebeu o sinal (-). Resultados e Discussão  As espécies  Acinetobacter johnsonii (3 isolados), Curtobacterium luteum, Bacillus pumilus subg. B., B. pumilus  (2 isolados), B. aureus, P11 (espécie não identificada), Staphylococcus aureus, B. amyloliquefaciens (4 isolados) e Paenibacillus gordonae reduziram concomitantemente onúmero de galhas, massa de ovos e ovos por gramade raiz (Tabelas 1 e 2), totalizando 15 dos 39 isoladosbacterianos endofíticos avaliados. As reduções variaram de 14 a 58 % para número de galhas porgrama de raiz, 28 a 77 % para número de massas porgrama de raiz e de 15 a 55 % para número de ovospor grama de raiz. Com exceção das espécies Curtobacterium luteum (P16) e Staphylococcus aureus (P18)e o isolado P11 isolados do pimentão, todas asbactérias que reduziram concomitantemente o númerode galhas, massas de ovos e ovos por grama de raizforam isolados do tomateiro (Tabelas 1 e 2).Dos 39 isolados e espécies bacterianas endofíticastestados, 67 % colonizaram as raízes de tomateiro.Das espécies que colonizaram raízes de tomateiro 69% reduziram o número de galhas, massas de ovos ouovos por grama de raiz. Dos 15 isolados que reduziramconcomitantemente galhas, massas de ovos e ovos porgrama de raiz, apenas três não colonizaram as raízesde tomateiro: P11 (espécie não identificada) e B.amyloliquefaciens   (T21 e T28), correspondendo a 80 %a relação entre controle e a colonização de raízes.   Estarelação sobe para 85 % quando se consideraseparadamente as três variáveis de eficácia de controle.Os isolados T2, T4, B. sphaericus (P53), B. cereus (P3), Paenibacillus gordonae (T37), B. marinus (T44), B.amyloliquefaciens (T50) e B. sphaericus (T54) colonizaramas raízes, mas não causaram redução de galhas, massasde ovos ou ovos por grama de raiz, correspondendo31 % das bactérias colonizadoras de raiz. Das bactériasisoladas do pimentão, apenas B. pumilus   (P20) nãocolonizou as raízes de tomateiro, mas não causoutambém redução de galhas, massas de ovos ou ovospor grama de raiz. As demais colonizadoras de raízesde tomateiro e isoladas de pimentão, três delascausaram redução do número de galhas, massas deovos e / ou ovos por grama de raízes e duas nadacausaram (Tabelas 1 e 2). As espécies que proporcionaram o melhor controlede  M. incognita em condições de casa-de-vegetaçãoforam  Acinetobacter johnsonii (T9 e T10), Curtobacterium luteum (P6), B. pumilus subg. B (T27), B. pumilus (T26) e B. amyloliquefaciens (T36), as quais colonizaram, também,as raízes de tomateiro (Tabelas 1 e 2). Resultadossemelhantes foram obtidos por Naves (2000), queconstatou reduções de 19 a 59 % no número de galhaspor grama de raiz e de 21 a 65 % no número de ovospor grama de raiz, em tomateiros infectados com  M. javanica  , tratadas com bactérias endofíticas. Halmann et al.  (1995) também verificaram uma redução em até50 % da infecção causada por  M. incognita em plantasde pepino.  Nematologia BrasileiraPiracicaba (SP) Brasil57  Efeito de Bactérias Endofíticas no Controle de Meloidogyne incognita e sua Capacidade de Colonização de Raízes de Tomateiro  Tabela 1 -  Efeito da microbiolização de sementes de tomateiro ‘Santa Cruz Kada’ com bactérias endofíticas sobre o número de galhas,massas de ovos e ovos de  Meloidogyne incognita por grama de raiz de tomateiro. Primeiro ensaio. Médias seguidas de mesma letra nas colunas não diferem entre si pelo teste de Scott Knott a 5 % de probabilidade. 1 Espécie não identificada. 2 Calculada com base na testemunha. 3 (+) colonizado ou (-) não colonizado. Espécie ou isolado Galhas / g de raiz Massas de ovos / g de raiz Ovos / g de raizColonizaçãoNúmero% Redução 2 Número% Redução 2 Número% Redução 2 radicular 3  Testemunha80,0 b-62,7 b-19.077 b--  Acinetobacter johnsonii   (T9)34,0 a57,527,0 a56,99.824 a48,5+  A. johnsonii   (T10)41,0 a48,829,7 a52,612.488 a34,5+ Bacilus cereus   (P13)102,7 c-60,0 b4,319.963 b-+ B. pumilus subg. B  (T27)47,7 a40,436,0 a42,611.101 a41,8+ B. pumilus (T39)176,7 d-106,3 c-42.348 c-- B. amyloliquefaciens (T41)72,3 b9,654,7 b12,816.201 b15,1- B. sphaericus   (T42)76,3 b4,635,7 a43,115.149 b20,6+ B. sphaericus (T43)69,3 b13,431,7 a49,49.762 a48,8+ B. marinus (T44)132,7 d-61,3 b2,218.764 b1,6+ B. sphaericus (T45)58,3 b27,141,7 a33,517.218 b9,7- B. amyloliquefaciens   (T50)150,7 d-85,0 c-22.540 b-+ B. sphaericus (T54)82,3 b-74,3 c-24.262 b-+ Curtobacterium luteum   (P16)48,7 a39,127,7 a55,811.074 a42,0+ T30 1 79,3 b0,943,7 a30,314.397 a24,5+ T35 1 65,0 b18,842,0 a33,018.221 b4,5- Paenibacillus gordonae   (T37)158,0 c-120,3 c-23.628 b-+ P. gordonae (T40)86,0 b-52,0 b17,117.243 b9,6- T38 1 80,7 b-41,7 a33,518.769 b1,6-CV (%)11,914,415,4-  Tabela 2 - Efeito da microbiolização de sementes de tomateiro ‘Santa Cruz Kada’ com bactérias endofíticas sobre o número de galhas,massas de ovos e ovos de  Meloidogyne incognita por grama de raiz de tomateiro. Segundo ensaio. Médias seguidas de mesma letra nas colunas não diferem entre si pelo teste de Scott Knott a 5 % de probabilidade. 1 Espécie não identificada. 2 Calculada com base na testemunha. 3 (+) colonizado ou (-) não colonizado. Espécie ou isolado Galhas / g de raiz Massas de ovos / g de raiz Ovos / g de raizColonizaçãoNúmero% Redução 2 Número% Redução 2 Número% Redução 2 radicular 3  Testemunha131,3 b-82,3 c-13.547 b--  Acinetobacter johnsonii (T 1)96,7 a26,454,7 b33,56.141 a54,7+ T2 1 267,7 c-77,3 c6,121.990 c-+ T4 1 126,3 b3,866,7 c19,021.077 c-+P11 1 113,0 a13,944,3 b46,28.515 a37,1- Staphylococcus aureus   (P18)114,0 a13,258,0 b29,57.516 a44,5+ Bacillus cereus   (T6)100,0 a23,849,7 b39,66.500 a52,0+ B. subtilis (P19)148,7 b-88,7 c-9.984 a26,3+ B. pumilus   (P20)136,3 b-80,7 c1,916.429 b-- B. amyloliquefaciens (T21)89,0 a32,246,0 b44,17.761 a42,7- B. amyloliquefaciens (T22)84,7 a35,554,3 b34,08.933 a34,1+ B. pumilus   (T26)68,7 a47,724,0 a70,86.705 a50,5+ B. amyloliquefaciens   (T28)90,0 a31,533,7 a59,114.261 b-- B. subtilis   (T31)210,7 c-89,3 c-16.493 b-- B. amyloliquefaciens (T36)78,0 a40,633,0 a59,98.200 a39,5+ B. pumilus   (T48)168,7 c-68,3 c17,013.003 b4,0- B. pumilus   (T49)89,7 a31,759,3 b27,99.959 a26,5+ B. pumilus   (T51)73,7 a56,145,0 b45,38.739 a35,5+ B. pumilus   (T52)151,7 b-77,3 c6,113.657 b-- B. sphaericus   (P53)162,3 c-89,3 c-31.607 d-+  Microbacterium liquefaciens   (T34)126,0 b4,067,3 c18,211.167 a17,6+ P. macerans   (T47)84,7 a35,553,7 b34,89.878 a27,1+CV (%)9,511,115,8-  58Vol. 33(1) - 2009 Renata S.C. Pinho, Vicente P. Campos, Ricardo Magela de Souza, Juliana R.C. Silva, Márcia S. Oliveira, Giselle C.S. Pimentel & Lílian S.A.S. Costa  Dentre os isolados mais promissores no controlede  M. incognita  , 53 % das espécies aqui estudadas foramdo gênero Bacillus   (Tabelas 1 e 2). Naves (2000),trabalhando com bactérias endofíticas isoladas deraízes de diversas plantas, selecionou sete isolados,todos Bacillus  , que proporcionaram as maioresreduções no número de galhas e de ovos de  M. javanica  em tomateiro. Sikora (1988) relatou reduções nainfecção de  M. arenaria, M. incognita em torno de 60 a65 % com o tratamento de sementes de várias culturascom Bacillus subtilis  . Em alguns estudos com bactériasdo gênero Bacillus foram obtidos resultados tãopromissores que Bchir & Bchir (2000) decidirampatentear uma combinação de Bacillus thuringiensis   e B.sphaericus  , denominada NOVO-BIOTECH – 7996,para o controle de fitonematóides. O uso de Bacillus  firmus   foi também patenteado para o controle defitonematóides, especialmente os do gênero  Meloidogyne (Feldman et al. , 1999). A alta ocorrência de bactérias colonizadoras darizosfera (67 %) dentre as bactérias endofíticas testadaspela técnica do Phytagel ® , alta relação entre eficáciade controle de  M. incognita   e colonização de raízes (85%) e a inclusão do grupo mais eficaz no controle de  M. incognita   como colonizadora de raiz (80 %),sustentam a recomendação do teste de colonizaçãode raízes como primeira seleção antes de se testar oantagonismo ao fitonematóide, reduzindo o númerode isolados e economizando tempo e esforços nostestes futuros in vitro e em casa de vegetação. A altarelação entre colonização de raízes por bactériasendofíticas e eficácia no antagonismo a fitopatógenostambém têm sido encontradas em outrospatossistemas. Silva et al.  (2003) verificaram umarelação de 100 % entre colonização de raízes porrizobactérias e eficiência de controle de Pseudomonas syringae pv. tomato em tomateiro e indicaram esse testepara seleção massal de rizobactérias. Apesar de nãose poder afirmar que um isolado que tem a capacidadede colonizar raízes in vitro o faça também em campo,trabalhos mostram que bactérias que colonizam osistema radicular apresentam significativo controle deespécies de  Meloidogyne  . Halmann et al.  (1998),trabalhando com bactérias endofíticas de algodão,observaram redução significativa do número de galhasem raízes de algodoeiro causadas por  M. incognita   euma correlação com o estabelecimento dessas bactériasdentro das raízes. Em trabalhos utilizando Pseudomonas aeruginosa   isolado IE-6 e um mutante resistente àestreptomicina IE-6 + capazes de colonizar os tecidosinternos de raízes de tomateiro, foi observada reduçãoda população de  M. javanica sob condições de campoe casa-de-vegetação (Siddiqui et al. , 2000; Siddiqui &Ehteshamul-Haque, 2001).Embora neste estudo grande relação ocorresseentre as bactérias colonizadoras de raízes de tomateiroe o antagonismo a  M. incognita  , espécies nãocolonizadoras também manifestaram antagonismo aesse nematóide A relação diversificada da bactériaendofítica com a rizosfera e antagonismo a  M. incognita  aqui constatado, sugere diferentes modos de atuaçãodessas bactérias com relação ao antagonismo a  M.incognita.  Ao que tudo indica a colonização de raízespor bactérias endofíticas está ligada à habilidade nautilização de exsudatos da planta. Segundo Kloepper et al.  (1985), os isolados de rizobactérias com maiorhabilidade na utilização de exsudatos de sementespossuem vantagem seletiva na colonização de raízes,pois durante o processo de germinação de sementesocorre liberação de carboidratos e aminoácidos emabundância na forma de exsudatos (Subrahmnyam et al. , 1983). Um outro modo de ação dessasrizobactérias envolve a transformação do exsudatoradicular em subproduto do seu metabolismo,impedindo que o nematóide reconheça o estímuloquimiotrópico, levando-o a perder suas reservasenergéticas e a infectividade (Bergerson, 1959;Christophers et al. ,   1997). Além disso, o processo dereconhecimento da planta pelo nematóide écontrolado por interações entre lectinas na superfícieda raiz e os carboidratos na cutícula do nematóide(Zuckerman, 1983) e, acredita-se que as rizobactériasse ligam às lectinas na superfície das raízes, interferindonesse processo de reconhecimento da plantahospedeira pelo fitonematóide (Stirling, 1991). Istopode explicar a atuação do grande grupo antagonistaa  M. incognita   e colonizadora de raízes relativas aosdados obtidos nos ensaios aqui relatados. As espécies  A. jonhsonii  , S. aureus  , P. gordonae  , B. pumilus   e o isolado P11 que reduziram a reprodução
Similar documents
View more...
We Need Your Support
Thank you for visiting our website and your interest in our free products and services. We are nonprofit website to share and download documents. To the running of this website, we need your help to support us.

Thanks to everyone for your continued support.

No, Thanks