CITOMETRIA DE FLUJO Y NEOPLASIAS DIGESTIVAS

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CITOMETRIA DE FLUJO Y NEOPLASIAS DIGESTIVAS T.M. MsCs(c) Juan Luis Castillo N. Citometría de flujo, Hospital del Trabajador, Concepción e mail: 1.- INTRODUCCIÓN La Citometría de
CITOMETRIA DE FLUJO Y NEOPLASIAS DIGESTIVAS T.M. MsCs(c) Juan Luis Castillo N. Citometría de flujo, Hospital del Trabajador, Concepción e mail: 1.- INTRODUCCIÓN La Citometría de Flujo es una tecnología que permite medir los más diversos parámetros celulares como antígenos de superficie, citoplasmáticos y nucleares, contenido de ácidos nucleicos, actividad enzimática, flujo de calcio, potencial de membrana y ph entre otros.(6,7) El principio básico de la Citometría de Flujo es la medición de un gran número de células, en forma individual, en un período muy corto de tiempo mientras se desplazan en un sistema de flujo o torrente líquido. Cada célula pasa por un punto donde son impactadas por un láser cuya luz es desviada o alterada de acuerdo a características propias de cada célula. La variación de la longitud de onda así producida, es captada y depurada por un complejo sistema de lentes y espejos especiales, que concentra esta luz y la transforma en pulsos de voltaje. Estos son codificados e interpretados por un computador provisto del programa adecuado. Los datos obtenidos de esta manera pueden manejarse muy versátilmente, siendo de gran confiabilidad y exactitud. Si además a estas células se les acoplan moléculas fluorescentes, que son excitadas y alteradas por el láser, se facilita la identificación de subgrupos específicos dentro de las grandes poblaciones celulares.( 6,7) Estas moléculas fluorescentes pueden estar acopladas a anticuerpos, fundamentalmente monoclonales, dirigidos contra diversos epítopes tanto intra como extra celulares. Bajo este concepto, es posible efectuar mediciones a poblaciones celulares, tanto eucariontes como procariontes, aplicadas a campos tan diversos como la biología celular, inmunología, hematología, patología, microbiología, farmacología, virología, etc. La determinación de ploidía de ADN y ciclo celular por Citometría de flujo, se ha realizado por más de dos décadas, demostrando que cambios en el contenido de ADN celular se presentan comúnmente en diversos tipos de cáncer.( 6,7,23,24,58) Las células marcadas con un fluorocromo, que se une estequiométricamente a los ácidos nucleicos, emiten fluorescencia proporcional al contenido cromosómico global. De esta manera se produce un patrón característico que refleja las fases del ciclo celular dentro de la población de células en estudio(6). El ciclo celular puede reflejarse en una curva que muestre las variaciones del contenido de ADN versus el número de células analizadas(6,7). La fluorescencia medida en las células en fase de resposo (G0) y en fase de presíntesis de ADN (G1), produce un pico con distribución normal(7,46). De la misma forma, las células en G2, que tienen duplicado su ADN con respecto a las células en G1, también producen un pico distribuido como una normal. Los mismos factores que afectan la amplitud de los picos G0G1 y G2M, también afectan la amplitud de la Fase S, por lo que en un histograma de ADN, las células que inician la Fase S se superponen con las células G1, como también lo hacen las células al final de la Fase S con las células en G2 (7,58). El contenido de ADN de una población celular se expresa como el índice de ADN, el cual se define como la razón entre el contenido de ADN de la población celular en estudio con respecto a células normales o células control(7,69). En muchos tumores humanos la ploidía representa un factor pronóstico (4,6,7,16,27,28,32,34,36,70). Por lo anterior, en estudios con diversos tipos de cáncer, tradicionalmente se ha relacionado la citometría de flujo con ploidía de ADN y ciclo celular, incluso usándose incorrectamente como sinónimos. En la actualidad la citometría de flujo en el estudio de diversas neoplasias, va más allá del estudio de ciclo celular y contenido de ADN, involucrando el estudio de diversos componentes celulares tanto de extra como intracelulares, lo que queda claramente ejemplificado por los estudios de caracterización inmunofenotípica de leucemias y linfomas. Actualmente, es posible estudiar una población tumoral, desde diversos ángulos, como por ejemplo, la expresión de diversas moléculas, tradicionalmente evaluadas por inmunohistoquímica (p53, PCNA, Ki67, bcl 2, mic, ras, ciclinas, receptores estrógenicos, etc.), el patrón inmunofenotípico de las diversas poblaciones leucocitarias presentes (linfocitos, macrófagos, granulocitos), y lógicamente el ciclo celular y contenido de ADN. En los últimos años, han aumentado los estudios funcionales en diversos tipos de cáncer, como por ejemplo la producción de citocinas por parte de células tumorales, estudios de resistencia a drogas citostáticas (fenotipo MDR: Multi drug resistance), así como el efecto de las mismas sobre el ph intracelular, el potencial de membrana, el flujo de calcio y otros iones, etc. Como podemos ver, las aplicaciones de la citometría de flujo en neoplasias, son amplias y en constante desarrollo. A continuación, revisaremos algunas de las aplicaciones de la citometría de flujo en el estudios de lesiones neoplásicas y pre neoplásicas del tracto gastrointestinal, desde distintos puntos de vista. 2.- Esófago Últimamente han aparecido varias publicaciones que intentan etapificar el carcinoma de esófago, sobre la base de parámetros histológicos y biológicos, en muestras obtenidas a partir de procedimientos endoscópicos y/o quirúrgicos (38,59,63,65). Dentro de los marcadores biológicos descritos como indicadores pronósticos, se encuentra las mucinas, en especial, la mucina 1, usada como marcador pronóstico en el carcinoma superficial de células escamosas (superficial squamous cell carcinoma, SCC) (38,52). Otro marcador pronóstico en el SCC, lo constituye el estudio de ciclo celular y contenido de ADN, siendo un patrón de ADN aneuploide relacionado con un pronóstico desfavorable (38,68). En forma similar, alteraciones en el p53, es posible encontrarlas como un evento primario en pacientes con acalasia, especialmente en áreas que muestran proliferación (38). A pesar de que se encuentra acumulación de p53 en la mayoría de los casos de cáncer de esófago, así como en tejido normal cercano al tumor, aún se evalúa su utilidad como factor pronóstico, no así en el caso de fenómeno metaplásicos (esófago de Barrett) (38,64). Otra molécula relacionada con el ciclo celular y cuya sobre expresión se observa en muchos tipos cáncer, es la ciclina D1. En el caso del cáncer de esófago, la presencia de una sobre expresión de ciclina D1, se correlaciona con una corta sobrevida.(38,66). Además se observa en forma más frecuente en pacientes añosos y en tumores bien diferenciados y moderadamente diferenciados. (3,38). Cuando la ciclina D1 se usa en combinación otras moléculas del ciclo celular, se puede definir un grado de malignidad, de acuerdo al número de moléculas alteradas. Entre estas moléculas, se encuentran Rb, p16ink4, p27kip1, PCNA, las moléculas de adhesión E caderina, alpha catenina y beta catenina, y las proteínas heat hock HSP27 y HSP70 (38,60). Los adenocarcinomas de la unión gastroesofágica, que presentan expresión de factor de crecimiento tumoral a (TGF a), pueden representar un fenotipo biológico más agresivo (12,38). Es de esperar, que la información obtenida a partir de biopsias endoscópicas sea cada vez mayor, tanto desde el punto de vista diagnóstico como pronóstico. En cualquier caso, las aplicaciones de técnicas de biología molecular y de citometría de flujo, sin duda serán fundamentales para obtener dicha información. En cuanto a marcadores biológicos relacionados con lesiones precancerosas, se han reportado varias asociaciones con esófago de Barrett. La presencia de células con ADN aneuploide, se relaciona estrechamente con la presencia de alteraciones histológicas severas (19,38). Dado que daño oxidativo del ADN causado por el reflujo gastroesofágico, sería seguido de mutaciones del p53, acumulación de proteínas y aneuploidia del ADN, se ha sugerido detectar estas alteraciones en forma rutinaria, a partir de biopsias.(19,38), así como también la expresión de cilclina E. (53). Por otro lado, uno de las características del esófago de Barrett, es el cambio en las características histoquímicas de las mucinas de la superficie epitelial. Chinyama et al(11,38) encontraron que la mucina intestinal MUC2 estaba presente en pacientes con esófago de Barrett, siendo las mucinas, marcadores capaces de diferenciar entre displasia y carcinoma en biopsias de mucosa, pudiendo ser usados como marcadores pronósticos. Algunos reportes plantean la medición de Ki 67 y p53 como algunos de los parámetros a comsiderar en la evaluación de la respuesta a tratamiento en esófago de Barrett(17,38). 3.- Linfoma Aunque la endoscopia y endosonografía son a menudo disgnósticos, el método más adecuado para la detección de esta neoplasia e las primeras etapas del tumor, lo constituye la evaluación histológica, incluyendo inmunohistoquímica (tradicional y por citometría de flujo). Al respecto, y según nuestra experiencia y la de otros, una buena estrategia diagnóstica, la constituye la determinación de subpoblaciones linfocitarias en mucosa gástrica, especialmente la determinación de linfocitos T (CD3) y B (CD19), y en estos últimos, la expresión de cadenas livianas de inmunoglobulinas del tipo kappa y lambda, a fin de evaluar clonalidad (18). Lo anterior, y según nuestra experiencia, tiene gran importancia en pacientes que al presentar infección por H. pylori, también presentan un aumento de las poblaciones linfoides a nivel de mucosa gástrica. 4.- Cáncer gástrico: La mayoría de los casos de cáncer gástrico son diagnosticados en etapas avanzadas, lo que se traduce en un pésimo pronóstico. Esto resalta la importancia de la identificación de marcadores diagnósticos y pronósticos para cáncer gástrico, en especial, en sus primeras etapas (10). La aneuploidía del ADN ha mostrado ser un marcador de conducta tumoral más agresiva en cáncer gástrico, siendo significativamente de peor pronóstico que los cánceres con ADN diploide (62). En el cáncer gástrico incipiente, la aneuploidía de ADN y el comportamiento de la Fase S se relacionan directamente con el pronóstico, permitiendo definir conductas terapéuticas a seguir, siendo esta información, junto con la etapificación endosonofráfica, fundamentales para efectuar procedimientos endoscópicos (polipectomias, mucosectomias) (28,30,34), incluso siendo un indicador útil, junto con la sobre expresión de p53, de compromiso ganglionar (54). Lynch O. Y colaboradores, mostraron claramente que el estudio de aneuplodía del ADN, es capaz de establecer subgrupos pronósticos en cáncer gástrico avanzado, dentro del mismo estadio de la enfermedad. Los pacientes con un índice de ADN elevado (mayor grado de DN aneuploide), tienen una curva de sobrevida porcentualmente más baja y significativamente diferente a los pacientes con menor grado de aneuploidia (34). Es así como tanto el índice de ADN como la Fase S entregan información sobre el devenir del tumor y este será más agresivo, mientras más aneuploide sea, y su vez, el tumor será menos agresivo si las condiciones son inversas. Lo anterior permite categorizar biológicamente al cáncer gástrico avanzado en de alto o bajo riesgo después del tratamiento quirúrgico (34). Recientemente se ha relacionado la sobre expresión de p53 con el pronóstico en cáncer gástrico, asociándose estas alteraciones con el grado de aneuplodia del tejido, incluso sugiriéndose que la pérdida del gen p53 tendría un papel en le proceso de aneuplodización del cáncer gástrico (62), siendo uno de los factores asociados con la transformación morfológica de células tumorales durante el proceso de carcinogénesis (62). A pesar de que varios cambios genéticos son comunes distintos tipos de cáncer, varias alteraciones genéticas características se han observado cuando se compara cáncer gástrico pobremente diferenciado y bien diferenciado. En el caso de cáncer gástrico bien diferenciado, la inactivación los genes supresores APC y DCC es prevalente. Sin embargo en cáncer gástrico pobremente diferenciado, la pérdida de los genes de E caderina y catenina, son los más prevalentes (10). 5.- Colon La Enfermedad Neoplásica del Colon incluye lesiones epiteliales adenomatosas planas y pólipoideas, ya que prácticamente todos los cánceres de colon comienzan como lesiones adenomatosas, de acuerdo a la progresión de la secuencia adenoma displasia carcinoma, la que ocurre por acumulación de cambios genéticos y ambientales(39). La mayoría de los cánceres de colon son adenocarcinomas, siendo los 2/3 de ubicación rectosigmoidea y 1/3 se ubica en el resto del colon(39). En un sentido amplio, se denomina pólipo a todo tumor localizado que protruye desde la pared a la luz intestinal, independientemente de su estructura histológica. El término Poliposis o Enfermedad Poliposa del Colon se aplica al estado de aparición de múltiples pólipos en el colon (26). Pueden ser únicos o múltiples y asentar en cualquier parte del colon. Según la superficie de fijación, se dividen en sésiles y pediculados. Histológicamente los pólipos de colon se clasifican en Neoplásicos y no neoplásicos. Los de tipo Neoplásico, a su vez se dividen en Benignos (Adenomatosos, Intermedios y vellosos) y Malignos (adenomas con carcinoma in situ). Por otro lado los pólipos de tipo no neoplásico se pueden clasificar en Mucosos, Hiperplásicos, Inflamatorios y Hamartomatosos (26,55,56). En relación a los pólipos neoplásicos del tipo adenomatoso, estos son tumores epiteliales escencialmente benignos, pero con potencial de malignización, según la secuencia pólipo cáncer, lo que sería el origen de los cánceres de colon. Tanto en humanos como en ratones, se han descrito alteraciones en la expresión mediadores de la transducción de señales en linfocitos infiltrantes de tumores con carcinoma de colon y de células renales, lo que también se ha descrito en linfocitos de sangre periférica (22,35,71). Dentro de las alteraciones que se han descrito, se incluye la pérdida de cadena zcd3, un elemento esencial en la transducción de señales, (13,14,22,35,). El receptor de células T (TCR) es el lugar de reconocimiento antigénico, proceso en el que participa el complejo CD3 que contiene un homodímero de una proteína llamada cadena z. Las cadenas z poseen tres copias de un inmunoreceptor de activación basado en tirosina (ITAM), el cual esta expresado en forma singular en las otras cadenas CD3 (1,31,35,71). En forma posterior a la interacción del TCR/CD3 con un ligando, los inmunoreceptores ITAM son fosforilados en los residuos de tirosina por miembros de las familias de kinasas Src (p56lck, p59fyn) y por la ZAP 70, permitiéndoles servir como ancla para reclutar y activar múltiples cascadas de señales intermedias que culminarán con la activación de la célula T y la secreción de citoquinas (1,22,31,37,71). Se han descrito alteraciones marcadas, que incluyen pérdida de cadena zcd3, un elemento esencial en la transducción de señales, en linfocitos infiltrantes de tumores de pacientes con carcinoma colorectal o de células renales (13,14,22,35,40). Evidencia que afirma la idea que la disminución en la expresión de cadenas z, puede ser uno de los responsable de la pérdida de competencia inmune, característica de pacientes con cáncer, y puede de hecho contribuir a la incapacidad del sistema inmune para enfrentar una neoplásia, con la consiguiente progresión de ésta (22,35,71). Usando Citometría de Flujo para la detección de cadenas z en linfocitos de sangre periférica, algunos autores han encontrado que su expresión disminuída, en pacientes con neoplasias, disminución que secorrelaciona con la etapa de la enfermedad, pronóstico e incluso muerte del paciente, además aquellos pacientes con compromiso de nódulos linfáticos o con metástasis tienen significativamente menos cadenas z que los pacientes con enfermedad localizada, lo que ha llevado a proponer la determinación de cadenas z en sangre períferica, como un marcador de progresión de la enfermedad (22,35). Al respecto, en el Hospital del Trabajador de Concepción, hemos estudiado la expresión de cadenas z en linfocitos T de sangre periférica en pacientes con pólipos adenomatosos de colon, los cuales son lesiones neoplásicas benignas. Es así como en un grupo de 19 pacientes con pólipos adenomatosos de colon, el promedio de expresión de cadenas z por parte de linfocitos T de sangre periférica fue de %, lo que difiere significativamente del 87.3 % de expresión de cadena z en linfocitos T, encontrado en un grupo de referencia de 18 pacientes (8). Estos resultados nos permiten sugerir la determinación de niveles de cadenas z CD3 en linfocitos T de sangre periférica como un parámetro a considerar al momento de evaluar a un paciente con antecedentes de póliposis o sangramiento fecal persistente, junto con una estrecha vigilancia endoscópica (8). 7.- Enfermedad Inflamatoria Intestinal Se define como enfermedad inflamatoria intestinal (EII) a un grupo de enfermedades inflamatorias crónicas, de etiología desconocida, de curso crónico y recurrente, que afectan al tubo digestivo(15,20). Los dos principales exponentes de la EII, son la Colitis Ulcerosa (CU) y la Enfermedad de Crohn (EC). Los patrones endoscópicos e histopatológicos característicos (aunque no patognomónicos)(9,20,42), son la base diagnóstica de la EII, previa exclusión de otras causas de inflamación intestinal (infecciosas, alérgicas, etc.)(5,20,42,50). Aunque la etiología precisa permanece desconocida, existe creciente evidencia de una alteración en la regulación del sistema inmune de mucosas, en la cual influyen: 1) antígenos luminales que actuarían como gatillantes (microorganismos patógenos exógenos, antígenos dietarios y, en especial, la flora intestinal)(51); 2) el epitelio intestinal, que presenta una permeabilidad aumentada, secreta citoquinas y actúa como células presentadoras de antígenos(15,41,51,61); 3) las células inmunes de la lámina propia, las cuales inician y perpetúan el proceso inflamatorio, al no responder a los mecanismos reguladores inhibitorios fisiológicos, que modulan la respuesta inmune de la mucosa digestiva, todo esto en el contexto de un huésped genéticamente predispuesto(15,41.42,51,61). Recientemente se han descrito alteraciones en el inmunofenotipo de algunas células del infiltrado inflamatorio en EII(21,25,43,44,45,48,61), en especial en los macrófagos de la lámina propia de la mucosa intestinal, los cuales en mucosa normal expresan un fenotipo único con funciones inmunes atenuadas (CD33++, CD44++, HLA DR bajo, CD14, CD16, CD11b, CD11c, CD80, CD86 )(49). En EII, los macrófagos de la lámina propia expresan fenotipos inmunológicamente más activos (mayor presentación antigénica, producción de citoquinas proinflamatorias y actividad migratoria)(2,33,41,47,61). Entre estos fenotipos se describen HLA DR alto, CD11b+, CD11c+, CD16+, CD14+, CD80+, CD86+(2,41,47,48). La expresión de molécula HLA DR, refleja la presentación de antígenos a las células T por los macrófagos de la lámina propia intestinal Esta presentación antigénica, se encuentra crónicamente elevada en EII(42). La descripción de este fenotipo (elevada expresión de HLA DR), evidencia la gran capacidad de presentar antígenos que muestran los MI de los pacientes con EII, en comparación con los pacientes con mucosa intestinal normal, en los cuales, los MI presentan una baja expresión de HLA DR. Lo anterior refleja la baja capacidad que tiene los MI de la mucosa normal, de activar células T, mediante presentación antigénica, lo que es muy importante dentro del equilibrio en el que se encuentra la mucosa. Esto ha sido demostrado por otros autores en estudios similares, señalando el elevado aumento del la expresión de la molécula HLA DR en MI de pacientes con EII y la baja expresión de ésta en mucosa intestinal normal(16,18). Al respecto, en el Hospital del Trabajador de Concepción, hemos estudiado la expresión de HLA DR y CD16 en macrófagos intestinales de pacientes con sospecha de EII, encontrando
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